Как сделать оксидазный тест

Добавил пользователь Дмитрий К.
Обновлено: 18.09.2024

Посев производят в пробирках на скошенный мясо-пептонный агар или другую среду, не содержащую крови. После инкубации вливают вниз по косяку 1 мл 3%-ной перекиси водорода. Сразу же и через 5 мин наблюдают за образованием пузырьков, которое означает положительную реакцию. Параллельно добавляют несколько капель 3%-ной перекиси водорода и к колониям на чашке или к зонам обильного роста, который может наблюдаться на поверхности полужидкой среды. Реакцию можно проводить и на предметном стекле: в этом случае на предметное стекло наносят несколько капель перекиси водорода, петлей снимают колонию и проводят наблюдения. В случае бульонной культуры к 0,5 мл культуры добавляют 0,5 мл 3%-ной перекиси водорода и наблюдают за постоянным образованием пузырьков. Некоторые бактерии, например молочнокислые на средах с низкими концентрациями глюкозы или вообще без глюкозы, образуют внегемовую псевдокаталазу. Образование псевдокаталазы можно предотвратить добавлением к среде глюкозы (1%). При проверке анаэробов на каталазную активность важно перед добавлением перекиси водорода выдержать культуру на воздухе в течение 30 мин. Положительный результат — Staphilococcus epidermidis, Escherichia coli, Mycjbacterium spp.; отрицательный — Streptococcus spp, Clostridium spp., Lactococcus lactis.

3.3.2. Тест на наличие оксидазы

Метод 1 (метод Ковача). На отрезок фильтровальной бумаги наносят несколько капель 1%-ного водного раствора дигидрохлорида тетра метил-п-фенилендиамина, приготовленного в тот же день. Выросшую культуру снимают с поверхности агаровой среды платиновой петлей (обычные петли из нихромовой проволоки могут давать ложноположительную реакцию) и наносят ее на увлажненную бумагу. Положительная реакция — развитие фиолетовой или пурпурной окраски в течение 10 с. Положительный результат дает Ps. aeruginosa, отрицательный — Е. coli.

Метод 2 (метод Эрлиха). Этот метод менее чувствительный, но более удобный. Несколько капель смеси (1: 1 по объему) 1%-ного раствора a-нафтола, растворенного в 95%-ном этаноле, и свежеприготовленного 1%-ного водного раствора оксалата диметил-и-фенилендиамина наносят на колонии в чашках с arapoм. В другом варианте к жидкой культуре добавляют 0,2 мл a-нафтола и 0,3 мл диметилпарафенилендиамина и энергично перемешивают. Положительная реакция: окрашивание колоний или бульонной культуры в фиолетово-синий цвет в течение 10 — 30 с.

3.3.3. Окислительно-ферментативный (о/f) тест на использование глюкозы (тест Хью — Лейфсона)

Готовят основной раствор исследуемого углевода (обычно глюкозы), стерилизуют его путем фильтрования (или в автоклаве при 0,5 атм) и добавляют с соблюдением правил асептики при 45 — 50 0 в автоклавированную полужидкую основную среду до конечной концентрации 0,5 — 1%. Чаще всего используют основную среду Хью и Лейфсона (г/л): пептон — 2; NaCl — 5; К2НРО4 — 0,3; бромтимоловый синий — 0,03; агар — 3; вода дистиллированная.

Если микроорганизмы не способны расти на этой среде из-за недостатка необходимых питательных веществ, добавляют дрожжевой экстракт (0,1%) или сыворотку крови (2%). Когда кислотообразование маскируется веществами щелочной природы, образующимися из пептона, можно использовать среду следующего состава (г/л): NН4Н2РО4 — 1,0; KC1 — 0,2; MgSO4 — 0,2; дрожжевой экстракт — 1,0; бромтимоловый синий — 0,03; вода дистиллированная; агар — 2,0; рН среды 7,0. В случае, когда рост тестируемого организма ингибируется бромтимоловым синим, следует заменить его феноловым красным или бромкрезоловым пурпурным.

1. Если кислота образуется только в аэробной пробирке, то клетки катаболизируют углевод с использованием О2 (реакция О). В этой пробирке рост должен быть заметным.

2. Если подкисление происходит и в аэробной и в анаэробной пробирках, то клетки способны также к брожению (реакция F). Рост должен быть заметен в обеих пробирках.

3. Если кислота не образуется ни в одной пробирке, то клетки не способны катаболизировать углевод. Если рост отсутствует, то возможно, что в среде нет какого-либо питательного вещества, необходимого для роста изучаемого организма.

Примеры: реакция F с глюкозой проявляется стафилококком (St. epidermidis), реакция О с глюкозой — микрококком (М. varians). Отрицательный результат с глюкозой характерен для Ps. lemoighei.

Метод основан на способности бактерий группы кишечных палочек сбраживать в среде Кесслера лактозу с образованием кислоты и газа. Бактерии группы кишечных палочек (БГКП) – это аэробные и факультативно-анаэробные, грамотрицательные, не образующие спор палочки, ферментирующие лактозу с образованием кислоты и газа при температуре 37 0 С в течение 24 часов (бродильная проба), не обладающие окислительной способностью.

Для индикации БГКП в исследуемом материале, 10 г продукта и 10 мл исходного разведения продукта засевают во флаконы со 100 мл и 50 мл питательной среды соответственно. По 1 мл и 0,1 мл и т.д. исходного разведения продукта вносят в пробирки с 5 мл питательной среды. По действующим нормативам засевается то количество продукта, в котором нормируется отсутствие бактерий группы кишечных палочек. Допускается засевать 1 г продукта в 10 мл питательной среды.

Для индикации БГКП в смывной жидкости с оборудования и рук, тампоны или марлевые салфетки опускают в пробирки с 5 мл среды Кесслера. Посевы помещают в термостат при температуре 37 0 С на 24 часа, затем из пробирок и колб с пузырьками газа в поплавках делают посев на плотную дифференциальную среду Эндо. Через сутки после инкубирования в термостате проводят учет. При наличии на среде Эндо колоний (красных с металлическим блеском и без него, розовых), характерных для группы кишечных палочек, проводят их изучение. Из изолированных колоний готовят препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии грамотрицательных, без спор палочек, делают заключение о присутствии БГКП. Для уточнения при обнаружении грамотрицательных, не образующих спор палочек надо провести оксидазный тест: часть колонии со среды Эндо наносят штрихом на фильтровальную бумагу, предварительно смоченную реактивом для определения цитохромоксидазы. Оксидазный тест у кишечной палочки отрицательный и индикаторная бумага не должна изменять цвет, а (если бумага синеет – оксидазный тест положительный).

Изучение культур, подозреваемых в причастности к возникновению болезни, начинают с изучения комплекса фенотипических признаков. Результаты исследования фенотипических свойств выделенного микроорганизма служат базой для его родовой и видовой идентификации, а также для решения основного вопроса: играет ли данный микроорганизм этиологическую роль (если он относится к категории патогенных) в диагностируемой инфекции.

В настоящем разделе представлены наиболее часто употребляемые в частной микробиологии биохимические и физиологические тесты, используемые при изучении микроорганизмов, выделяемых от больных с разнообразными инфекциями.

Для определения качества питательных сред и реагентов, используемых для постановки заданного теста, и адекватности полученных результатов видовым признакам испытуемого микроорганизма в реакцию вводят две контрольные культуры, соответствующие положительному и отрицательному результату реакции теста.

Для контроля используют эталонные штаммы микробных культур из национальных микробиологических музеев. Таковыми чаще всего являются коллекционные культуры американского типа — АТСС (American Type Culture Collection, USA), национальные типовые коллекционные культуры (NCTC) Центральной публичной лондонской лаборатории (Central Public Health Laboratory, London, UK), а также штаммы музея патогенных бактерий ФГУН Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля биологических медицинских препаратов им. Л. А. Тарасевича.

В провинциальных городах ввиду отсутствия или затруднений с получением эталонных культур, внесенных в каталоги учреждений, имеющих государственные музеи микробных культур, используют в качестве контрольных штаммы, выделенные в собственной лаборатории, тщательно проверенные и снабженные сопроводительным документом, куда внесены присвоенный им номер, наименование, источник и дата выделения, перечень характерных признаков, имеющих дифференциально-диагностическое значение.

Оксидоредуктазы — класс ферментов, катализирующих окислительно-восстановительные реакции, которые лежат в основе метаболических процессов, обеспечивающих жизнеспособность всех без исключения животных и растительных организмов, в том числе и бактериальных клеток.

Окислительно-восстановительные реакции протекают с участием двух субстратов (окисляемого и восстанавливаемого). Окисление характеризуется отщеплением атомов водорода (протонов) H + или электронов от субстрата-донора, восстановление — присоединением протонов или электронов к субстрату-акцептору. Различают следующие основные оксидоредуктазы: аэробные оксидазы (гидрогеназы), анаэробные дегидрогеназы и цитохромоксидазы.

а) Оксидазные тесты. Оксидазные тесты используют для дифференциации представителей родов Neisseria, Alcaligenes, Aeromonas, Vibrio, Campylobacter, Pseudomonas, обладающих оксидазной активностью, и оксидазоотрицательных Enterobacteriaceae.

Тест основан на том, что у некоторых бактерий биологическое окисление в целях получения энергии осуществляется при помощи цитохромоксидазы либо индофенолоксидазы — железосодержащего белка гемопротеина, который катализирует перенос электронов от вещества-донора (например, НАД-Н) к веществам-рецепиентам (обычно к O2). Чтобы визуализировать этот процесс, пользуются методами Ковача (Kovacs) или Гэби-Гедли (Gaby-Hadley), основанными на введении в питательную среду искусственных бесцветных реагентов в восстановленном состоянии, которые в присутствии микробной оксидазы окисляются и приобретают соответствующую им окраску.

При контакте с тетраметил-п-фенилендиамином (реактив Ковача) колонии, продуцирующие цитохромоксидазу, в ближайшие 10-30 с из бесцветных превращаются в темно-фиолетовые вследствие образования окрашенного соединения — вурстеровского синего. Реакцию можно ставить, используя полоски фильтровальной бумаги, пропитанной реактивом Ковача.

в) Метод Гэби-Гедли. В присутствии цитохром-оксидазы N,N-метидил-фенилаланин с альфа-нафтолом (компонентом реактива) образует соединение индофенол синий. Цитохромоксидазные колонии и мазки, приготовленные из них, на фильтровальной бумаге в течение первой минуты окрашиваются в отчетливо синий цвет.

г) Тест на каталазу. Каталаза (греч. katalysis — разрушение) — фермент, способствующий расщеплению перекиси водорода на воду и молекулярный кислород.

Тест на каталазу в практике микробиологических исследований используется очень широко для дифференциации и идентификации ряда патогенных и условно-патогенных бактерий.

Процесс образования каталазы может происходить в широком температурном диапазоне (+15. +40°С) при значениях pH от 4,5 до 9,0. Тем не менее при постановке теста на определение каталазы инкубацию посевов проводят традиционно при 36(±1)°С, а каталазную активность принято определять при исходно нейтральном значении pH в условиях комнатной температуры (+20. +22°С).

Тест основан на том, что с первых же секунд контакта с каталазой перекиси водорода начинается ее расщепление, сопровождающееся более или менее интенсивным выделением пузырьков кислорода.

Посевы инкубируют при 36(±1)°С не более суток. Для выявления каталазы у выделенных культур предложено 2 способа:

Способ 1. На поверхность выращенной в чашке Петри или пробирке микробной культуры наносят тест-реактив — свежеприготовленный 3%-ный раствор перекиси водорода с таким расчетом, чтобы он тонким слоем покрыл поверхность культуры.

Способ 2. На чистое, хорошо обезжиренное предметное стекло наносят каплю свежеприготовленного 3%-ного раствора перекиси водорода и эмульгируют в ней 1 петлю исследуемой культуры.

При наличии каталазы в микробной культуре на поверхности среды или в капле раствора перекиси водорода на предметном стекле в первые же 2-3 с появляются пузырьки кислорода. Газообразование может быть бурным или умеренным. Независимо от его интенсивности реакция учитывается как положительная. Появление единичных пузырьков или наступление газообразования в более отдаленные сроки (13-15 с) расценивается как реакция сомнительная, требующая повторной постановки. Отсутствие газообразования или появление одиночных пузырьков газа через продолжительное время после добавления реактива определяется как реакция отрицательная.

Лабораторная диагностика гонореи проводится при помощи бактериоскопического и бактериологического анализа, реже используется серологический и иммуноферментный метод.

Гонорея – инфекционное заболевание, возбудителем которого является гонококк. Впервые гонококки были описаны немецким дерматовенерологом Альбертом Нейссером. Отсюда возбудители гонореи получили название Neisseria gonorrhoeae.

Морфология

Гонококки являются диплококками бобовидной формы и внешне напоминают кофейные зерна. Гонококки - грамотрицательные бактерии, при окрашивании по методу Грама они приобретают красный цвет. Под воздействием внешней среды (химических препаратов, лекарств) гонококки могут менять размеры и форму, становиться грамположительными. Способность гонококков менять свойства часто осложняет диагностику гонореи.

Neisseria gonorrhoeae

Культуральные свойства

Гонококки хорошо размножаются в жидких питательных средах и на плотных средах с рH от 7,2 до7,4 единиц, содержащих нативный человеческий белок (асцитную жидкость, кровь, сыворотку крови). Культивирование гонококков происходит при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере, содержащей 3 – 5 % углекислого газа. При дальнейшем культивировании потребность в углекислом газе отпадает.

Устойчивость во внешней среде

Во внешней среде гонококки малоустойчивы. На них пагубно влияет повышение и понижение температуры, высыхание, прямые солнечные лучи. Бактерии погибают при самых малых концентрациях дезинфицирующих средств. Но во влажной среде, например, в гное, на грязном белье они могут сохранять свою жизнеспособность до 24 часов.

Эпидемиология

Гонорея – антропогенное заболевание, передаётся только от человека к человеку. Гонорея не переносится животными. Инфекция распространяется при половых контактах, очень редко бытовыми способами, например, через грязное белье. Заболеванию подвержены люди, часто меняющие половых партнёров (девиантные, асоциальные слои населения). Заражение начинается с момента полового контакта с носителем инфекции, инкубационный период длится от одного дня до одного месяца, обычно около недели. У 70 % женщин и 10 % мужчин заболевание проходит бессимптомно.

Диагностика гонореи

Своевременная диагностика венерического заболевания позволяет остановить распространение инфекции по организму и безотлагательно начать лечение. В России порядок проведения диагностики гонореи регламентирован приказом Министерства здравоохранения РФ от 20.08.2003 № 415 и заключается в обязательном осуществлении бактериоскопического исследования с последующим бактериологическим подтверждением, которые помогают быстро определить наличие инфекции.

Бактериоскопический анализ

Бактериоскопический анализ применяют с целью изучения морфологических свойств возбудителя. Из клинического материала (например, отделяемого поражённой слизистой оболочки уретры или цервикального канала) готовят мазок, который фиксируют на стекле и окрашивают анилиновыми красителями по методу Грама.

Отдел новых технологий ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера для проведения бактериоскопического исследования выпускает наборы реагентов для окраски по Граму в трёх разных вариантах.

  1. В состав комплекта № 1 входит фуксин Циля, окрашивающий гонококки в розовый цвет.
  2. В комплекте № 2 фуксин Циля заменен на водный раствор нейтрального красного, в результате чего грамотрицательные бактерии приобретают ярко-оранжевый цвет и хорошо видны на контрасте с фиолетовой окраской грамположительных бактерий.
  3. Наибольшую контрастность получают при применении комплекта № 3, в котором используются в качестве красителей бриллиантовый зеленый и сафранин. Грамположительные микроорганизмы приобретают зеленый цвет, а грамотрицательные – красный.

набор для окраски по Граму

Бактериоскопический метод имеет следующие недостатки:

  1. необходима высокая концентрация бактерий в исследуемом материале, не менее 10 9 КОЕ/мл, в противном случае гонококки могут быть не выявлены;
  2. при ошибках в технике окрашивания бактерии могут повести себя нетипичным образом и окраситься в другие цвета;
  3. гонококки полиморфны – они могут менять размеры и окраску под воздействием различных препаратов.

Бактериологический анализ

Для эффективной диагностики гонореи бактериоскопический анализ дополняют бактериологическим анализом, при котором исследуемый материал высевают на питательные среды для получения чистых культур возбудителя.

Отдел новых технологий ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера выпускает набор реагентов для выделения гонококков культуральным методом - набор "СВГ". В состав набора входит основа питательной среды и лиофильно высушенная селективная и ростовая добавка. Добавка содержит необходимые для роста гонококков белки, свойственные организму человека, углеводы, аминокислоты, витамины и прочие соединения.

Селективный компонент в виде комплекса антибиотиков подавляет рост посторонней микрофлоры. Благодаря селективному компоненту на питательной среде, выпускаемой Отделом новых технологий, образуются только колонии гонококков, которые очень легко визуально обнаружить.

Бактериологическое исследование завершают проведением бактериоскопии мазков, приготовленных из выросших колоний. Также для контроля морфологии возбудителя проводят тесты для обнаружения цитохромоксидазы (оксидазный тест) и бета-лактомазы – ферментов, продуцируемых гоноккоками.

Отдел новых технологий ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера выпускает два набора реагентов, которые обнаруживают цитохромоксидазу по методу Эрлиха и по методу Ковача. Из этих реагентов готовят рабочие растворы. Растворами обрабатывают выросшие колонии. При взаимодействии реактива Эрлиха и цитохромоксидазы колонии гонококков окрашиваются в синий цвет, при использовании реактива Ковача – в красный.

Также мы предлагаем наборы реагентов для экспресс-определения бета-лактамазы, продуцируемой гонококками. Обнаружение в исследуемом материале бета-лактамазы свидетельствует о резистентности выделенных гонококков к пенициллинам, к цефалоспоринам.

Преимущества препаратов для диагностики гонореи, выпускаемых Отделом новых технологий ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера:

Лабораторный анализ для определения эффективности работы системы антиоксидантной защиты (САЗ) в организме. Нарушение работы САЗ ведет к возникновению оксидативного стресса и, как следствие, нарушению работы клеток.

Приём и исследование биоматериала

Комплексы с этим исследованием

Когда нужно сдавать анализ Общий антиоксидантный статус (TAS)?

  1. Диагностика недостаточного количества антиоксидантных веществ в организме;
  2. Определение риска развития заболеваний, которые связаны с дефицитом антиоксидантов;
  3. Изучение активности антиоксидантного статуса организма для оценки эффективности проводимого лечения;
  4. Диагностика врожденных форм дефицита ферментов из группы антиоксидантов.

Подробное описание исследования

В норме в живых тканях непрерывно протекают окислительные реакции. Свободнорадикальное окисление наблюдается в каждой клетке организма — это физиологический процесс, который обеспечивает быстрое изменение свойств и структуры плазматических мембран. Также перекисное окисление лежит в основе фагоцитоза — процесса устранения чужеродных микроорганизмов и поврежденных клеток макрофагами и лимфоцитами.

Перекисному окислению в первую очередь подвергаются липиды, в меньшей степени —нуклеиновые кислоты и белки. В здоровом организме интенсивность перекисных окислительных процессов относительно стабильна и протекает примерно на одном и том же уровне благодаря многофакторной системе нейтрализации свободных радикалов — системе антиоксидантной защиты (САЗ или TAS).

Несмотря на некоторые положительные свойства активных форм кислорода (АФК), их накопление способствует развитию множества патологических реакций. Кроме того, АФК принимают участие в развитии аутоиммунных реакций (окисленные липиды имеют антигенные свойства). Именно поэтому в организме существует система антиоксидантной защиты, которая способна контролировать интенсивность окислительных процессов. Важнейшие ферменты САЗ — это супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза и каталаза. Данные вещества либо ускоряют распад кислорода (его активных форм), либо расщепляют молекулы АФК до воды и нетоксичных форм.

Помимо ферментов, в систему САЗ входят витамины A, С и E, а также каротиноиды и стероидные гормоны. Дисбаланс между образованием и накоплением свободных радикалов и активности антиоксидантной системы повышает уровень ПОЛ (перекисного окисления липидов) в клетках. Это увеличивает риск развития оксидативного стресса, что впоследствии может привести к повреждению клетки — появлению мутаций в генетическом материале, повреждению мембраны, изменению действий ферментов и поражению митохондрий.

Установлено, что показатель общего антиоксидантного статуса может быть прогностическим фактором хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). У пациентов, страдающих ХОБЛ, уровень TAS гораздо выше, чем у здоровых людей — причём у мужчин он обычно больше, чем у женщин.

Таким образом, общий антиоксидантный статус (TAS) — это отражение баланса (или его отсутствия) между двумя разнонаправленными реакциями: системой антиоксидантной защиты (САЗ) и образованием активных форм кислорода.

Читайте также: